Vacunación en rodaballo, Scophthlamus maximus (L.): análisis de la respuesta inmunitaria y desarrollo de nuevos adyuvantes

En esta tesis doctoral se han estudiado las respuestas inmunitarias innata y adaptativa en el rodaballo durante la vacunación intraperitoneal con el escuticociliado Philasterides dicentrarchi, poniendo énfasis en la respuesta de las células peritoneales y el bazo. En primer lugar, se ha estudiado la respuesta de las células peritoneales durante la vacunación con varios adyuvantes y antígeno de P. dicentrarchi. Por otra parte, se ha analizado la respuesta humoral en el bazo durante la vacunación. También se han secuenciado y caracterizado genes relacionados con la respuesta inmunitaria y se ha observado su regulación durante la vacunación con el escuticociliado. Finalmente, se han desarrollado nuevos adyuvantes basados en polisacáridos de origen natural que pueden ser empleados en vacunas contra la escuticociliatosis

Emprego do peixe cebra (Danio rerio) coma modelo de estudo de neoplasias

Traballo Fin de Grao en Veterinaria. Curso 2018-2019Durante las últimas décadas el pez cebra se ha convertido en un organismo modelo importante en la investigación biomédica. Los avances técnicos han permitido generar modelos de cáncer en diferentes órganos del pez cebra, manteniendo una gran similitud con las características de malignidad en los humanos, tanto histológicamente como genéticamente. Este modelo ha revelado datos únicos acerca de la patogenia y progresión del cáncer que, mediante experimentos tradicionales, no se habrían obtenido.Durante as últimas décadas o peixe cebra converteuse nun organismo modelo importante na investigación biomédica. Os avances técnicos permitiron xerar modelos de cancro en diferentes órganos do peixe cebra, mantendo unha gran semellanza coas características de malignidade en humanos, tanto histolóxica como xenéticamente. Este modelo revelou datos únicos sobre a patoxénese e progresión do cancro que, a través de experimentos tradicionais, non se obtiveron.Throughout the last few decades, the zebra fish has become an important model organism for biomedical research. Technological advancements have allowed cancer models to be created in different organs of the zebrafish, maintaining a high similarity with the malignancy features in humans, histologically and genetically. This model has reveals unique data regarding pathogeny and cancer progression, which through traditional experiments could not have been obtained

Caracterización de la respuesta inmunitaria en mucosas y su modulación a través de la dieta en trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss)

El impacto de las enfermedades infecciosas en acuicultura continúa siendo uno de los factores limitantes para el crecimiento de este sector productivo. Por este motivo, es necesaria la búsqueda de tratamientos inmunoestimulantes que incrementen la respuesta inmunitaria de los peces y los hagan más resistentes a los patógenos. Así mismo, otra de las grandes demandas del sector es la optimización de vacunas de administración masiva, tanto por baño como por vía oral. En ambos casos, las mucosas (tejidos que se encuentran en contacto directo con el medio externo) juegan un papel principal en la activación de la respuesta inmunitaria, pero por el momento no se han esclarecido los mecanismos de regulación inmune de estos tejidos. En esta Tesis Doctoral hemos caracterizado la distribución del sistema inmunitario en la piel de trucha arcoíris, para posteriormente analizar su regulación en respuesta a una infección viral, comparándola con la respuesta generada en un órgano linfoide secundario central como el bazo. En este estudio, hemos demostrado que la piel es un tejido rico en células T y que éstas no se distribuyen homogéneamente, sino que se encuentran en mayor concentración en la zona adyacente a las branquias, presentando las células B un perfil semejante. Asimismo, hemos visto como, en respuesta a una infección con el virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV), las células T se activan a nivel local sugiriendo que la piel puede actuar en los peces como un órgano linfoide secundario. Posteriormente, hemos analizado como se modula la respuesta inmunitaria tanto en mucosas como en órganos linfoides centrales en peces alimentados con una dieta suplementada con distintos inmunoestimulantes y vitaminas, comparando los efectos producidos tras 15 días de administración con los observados tras 30 días. Este trabajo muestra como la modulación de la respuesta inmunitaria es posible mediante piensos suplementados, obteniéndose no sólo diferencias a nivel transcripcional en los distintos tejidos, sino también incrementando el título de anticuerpos naturales en el suero y disminuyendo la carga viral tras una infección con VHSV. Por último, quisimos profundizar en los mecanismos inmunitarios regulados por una de las sustancias contenidas en la dieta suplementada ProtecTM, la vitamina C. Para ello, estudiamos los efectos de dicha vitamina en una línea celular establecida de monocitos/macrófagos de trucha (RTS11) y en leucocitos de trucha in vitro. Los efectos potenciadores de la vitamina C sobre la producción de radicales de oxígeno, la capacidad fagocítica y la producción de factores pro-inflamatorios y antimicrobianos podría explicar la mejor respuesta antibacteriana que se observa en animales alimentados con dietas suplementadas con esta vitamina

PATOGENIA DEL VIRUS DE LA NECROSIS PANCREÁTICA INFECCIOSA

La presente tesina es una revisión bibliográfica sistemática y exhaustiva de la patogenia del virus de la necrosis pancreática infecciosa, con base en la teoría respuesta – daño; propuesta por Casadevall y Pirofski (2003).RESUMEN El virus de la necrosis pancreática infecciosa (VNPI) es el agente causal de la enfermedad conocida como necrosis pancreática infecciosa (NPI). De manera natural los salmónidos son los peces más susceptibles. El curso agudo de la enfermedad puede provocar una mortalidad hasta del 100% en salmónidos jóvenes. En las truchas, la susceptibilidad a la enfermedad disminuye con la edad. Los peces infectados transmiten el virus por vía horizontal y vertical, esto promueve que el virus se encuentre de forma continua en el agua y que infecte a otros peces. Al alcanzar los 1500 grados-día (valor que se obtiene multiplicando los días de edad de los peces, por el promedio de la temperatura en grados Celsius durante su esperanza de vida), los peces resisten más a la enfermedad. Los signos clínicos que presentan los peces afectados por el VNPI son: anorexia, ataxia, hiperventilación, obscurecimiento de piel (hiperpigmentación), hemorragias en áreas ventrales y aletas. Con base en ésto, un pez puede estar infectado mas no enfermo, y un pez enfermo sí está infectado. Por la complejidad del proceso salud - enfermedad, Casadevall y Pirofski propusieron una nueva teoría de la patogenia microbiana, empleando modelos de microorganismos patógenos en los humanos. Esto nos lleva a revisar los conceptos propuestos por estos autores, haciendo énfasis en modelos de patógenos importantes en el área de la Medicina Veterinaria. En nuestro país, el virus de la necrosis pancreática infecciosa fue reportado en 2002 y afecta principalmente a truchas jóvenes de unidades de producción intensiva. El virus ha sido aislado en unidades de producción trutícola de las siguientes entidades: México, Hidalgo, Morelos, Michoacán, Puebla, Chihuahua, Durango y Veracruz. Conocer la patogenia microbiana del único virus identificado y confirmado hasta ahora en la trutícultura nacional es de vital importancia. Palabras clave: patogenia microbiana, VNPI, trucha arcoíris.“Serotificación y virulencia de aislados mexicanos del virus de la necrosis pancreática infecciosa”, financiado por CONACYT, CB-257781, con registro interno 4226/2016C; responsable técnico Dra. en C. Celene Salgado Miranda

Estudio de la patogenia y de los mecanismos inmunológicos en la infección por Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida en rodaballo (Scophthalmus maximus)

A. salmonicida subsp. salmonicida (A. salmonicida) es uno de los principales patógenos de los peces, incluido el rodaballo. En esta memoria hemos profundizado en el conocimiento de la enfermedad causada por A. salmonicida y el efecto la vacunación en el rodaballo, abordando aspectos relacionados con las lesiones, el diagnóstico, la patogenia y la respuesta inmunitaria. La identificación del antígeno bacteriano se llevó a cabo mediante el desarrollo de una técnica inmunohistoquímica, la cual demostró ser una herramienta útil para el estudio y el diagnóstico de la enfermedad. La forma aguda de la enfermedad se analizó a partir de un modelo experimental de infección. Los peces desafiados desarrollaron septicemia, observándose el antígeno bacteriano de forma libre dentro de vasos sanguíneos y en tejidos. Además, el antígeno bacteriano se localizó dentro de fagocitos mononucleares, indicando su endocitosis y la posible supervivencia intracelular del patógeno. Los peces infectados mostraron un incremento significativo del número de células inmunorreactivas para el TNF-α y la enzima iNOS en los órganos linfo-hematopoyéticos, sugiriendo la activación de los fagocitos y su participación en la respuesta inmunitaria. A su vez, el incremento de la actividad de estos efectores inmunitarios durante un proceso septicémico podría estar implicado en la patogenia de la enfermedad. La forma crónica de la enfermedad se describió a partir de rodaballos de cultivo. Esta forma de enfermedad se caracterizó por el desarrollo de granulomas dérmicos, lo cual señala la importancia de la inmunidad celular frente a la infección. Las reacciones granulomatosas también denotan un posible fallo en la eliminación del patógeno, por lo que estos hallazgos aportan datos relevantes a fin de identificar peces enfermos que podrían actuar como fuente de infección. Finalmente, se evaluó la eficacia de vacunas (acuosa y oleosa) formuladas con bacterinas. Mediante un ensayo experimental se analizó el grado de protección, las lesiones ocasionadas por la vacunación y la cinética del antígeno vacunal. La vacuna oleosa mostró una protección moderada a los 90 días post-vacunación. El adyuvante oleoso generó una celomitis granulomatosa, detectándose el antígeno vacunal asociado al material oleoso. La vacuna acuosa causó una celomitis leve y el antígeno vacunal se localizó en fagocitos mononucleares dentro de cavidad celómica, riñón y bazo. No obstante, la vacuna acuosa no indujo protección. En este trabajo se demostró que el análisis histológico e inmunohistoquímico resultan imprescindibles para evaluar el efecto y la inocuidad de las vacunas frente a A. salmonicida, con el propósito de contribuir a determinar la eficacia de las mismas en el rodaballo

Papel de Fast ("Fas-activated serine threonine phosphoprotein") en la fagocitosis de las bacterias por parte de los macrófagos

Esta Tesis Doctoral estudia los efectos de la ausencia de FAST (Fas-activated serine threonine phosphoprotein) en la capacidad fagocítica de los macrófagos en ratones y humanos. Nuestros resultados muestran que los macrófagos deficientes en FAST (knockout, KO) tienen una capacidad aumentada de fagocitar bacterias Escherichia coli en ensayos in vitro e in vivo. Los macrófagos KO también presentaron un ligero aumento de la fagocitosis de Staphylococcus aureus pero no resultó ser significativo. La evaluación de los receptores TLR2 y TLR4 y de diferentes marcadores de maduración no reveló diferencias entre macrófagos de ratones silvestres y KO. Ambos grupos de macrófagos presentaron similar capacidad bactericida y de producción de radicales de oxígeno. Los conteos bacterianos a tiempos iniciales en el ensayo de protección con gentamicina se correlacionaron con los índices fagocíticos. También demostramos que el aumento de la capacidad fagocítica esta presente en macrófagos humanos derivados de la línea celular THP-1 cuando se silencia la expresión de FAST mediante RNA de interferencia. En conclusión, nuestros resultados revelan un nuevo papel de FAST en la regulación de la fagocitosis y contribuye en la compresión de las bases moleculares y funciones celulares de FAST y sus homólogos.Departamento de Anatomía Patológica, Microbiología, Medicina Preventiva y Salud Pública y Medicina Legal y Forens

Caracterización de Aeromonas salmonicida ssp salmonicida y estudio de los mecanismos de interacción con el hospedador

La tesis se centra en la caracterización taxonómica, estudio del grado de virulencia y de factores celulares y extracelulares asociados con la patogenicidad de cepas de Aeromonas salmonicida aisladas de peces salmónidos y no salmónidos. Se han desarrollado herramientas y técnicas para el estudio de la respuesta inmune de los peces frente a la infección y a la inmunización y se ha valorado la eficacia de la vacunación frente a la forunculosis en el grado de protección de los peces y en varios parámetros del sistema inmune innato y adquirido

Virus de salmónidos: estudios sobre vacunas orales y prevención de persistencia viríca

En esta tesis se estudiaron los perfiles de transcripción de respuesta génica en tejidos de trucha vacunadas por vía oral con pcDNA-VP2 frente al virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa mediante microarray y validados por RT-qPCR. Se demuestra que los perfiles transcriptómicos de peces vacunados tienen una tendencia similar a los infectados, y existe una regulación diferencial de quimioquinas y receptores de quimioquinas en los cinco segmentos del intestino. El IPNV provocó una movilización de células IgM e IgT en el intestino anterior y ciego pilórico, y de células CD3 en ciego pilórico, intestino medio y posterior. Además, se identificaron células IgM e IgT en el espacio intersticial de adipocitos que fueron reguladas por la vacuna oral pcDNA-VP2. La vacuna pcDNA-VP2 protege a los peces cuando se incorpora en el alimento y es capaz de evitar la presencia de animales portadores en los supervivientes a la infección. La vacuna DNA oral pIRF1A-G frente al virus de la Necrosis Hematopoyética Infecciosa (IHNV) es dosis dependiente y a dosis de 100 microgramos presenta niveles de protección semejantes a la vacunación intramuscular. También se caracteriza la respuesta transcripcional en riñón anterior de truchas infectadas con IHNV en dos etapas de la enfermedad, utilizando RNA-seq

Riesgos tóxicos por cianotoxinas en peces de consumo : optimización de métodos de análisis, potenciales mecanismos de toxicidad y tratamiento

Las cianobacterias han ido adquiriendo gran importancia a lo largo de los años debido a su capacidad de formar floraciones o ¿blooms¿, las cuales pueden llegar a ser tóxicas debido a la producción de cianotoxinas, por lo que se han convertido en una preocupación a nivel mundial en materia de contaminación ambiental, toxicológica, sanitaria y económica, ya que pueden afectar tanto a animales y plantas como a seres humanos. De todas las cianotoxinas, y dado que son las únicas que han causado fenómenos masivos de intoxicación en poblaciones humanas, merecen especial atención las Microcistinas (MCs) y la Cilindrospermopsina (CYN), constituyendo esta última el principal objeto de estudio de la presente Tesis Doctoral. Por todo ello, decidimos realizar una serie de estudios para investigar, en primer lugar, los efectos que pueden tener diferentes técnicas usuales de cocinado en las concentraciones de MCs en el pescado contaminado destinado al consumo humano. En el caso de la CYN, en primer lugar, nos pareció importante la puesta a punto y validación de métodos analíticos para cuantificar la toxina en diferentes matrices, y posteriormente decidimos profundizar en su mecanismo de toxicidad y sus efectos tóxicos, así como estudiar alternativas que nos permitieran contrarrestar los daños producidos por dicha toxina. Asimismo, también estudiamos su distribución en tejidos de peces contaminados. Todo ello en una de las especies acuáticas de consumo humano que pueden verse afectadas por esta toxina en su hábitat natural, como es el pez tilapia (Oreochromis niloticus). Por otra parte, también se ha abordado, mediante proteómica, el estudio del repertorio de Glutatión-S-transferasas (GSTs) en branquias de bivalvos, y los efectos de la CYN sobre plantas de consumo humano, como son las zanahorias (Daucus carota), expuestas a la toxina mediante el agua de riego. Una de las vías de exposición a MCs más importantes es la vía oral. Además, las MCs pueden bioacumularse en organismos acuáticos, pudiendo ser transferidas a lo largo de la cadena trófica hasta los escalones más altos, y llegando así a los seres humanos, por lo que el consumo de estos animales acuáticos contaminados representa un riesgo potencial para la salud humana. Así, una correcta evaluación de riesgos de la exposición humana a MCs a través de los alimentos requiere de un detallado conocimiento acerca de la influencia del procesado y cocinado del alimento sobre estas toxinas. Es por ello que nos propusimos investigar los posibles cambios en la concentración de MCs libres en músculo de tilapias (Oreochromis niloticus) (porción comestible) a las que se les añadió una mezcla de MCs puras (MC-LR, MC-RR y MC-YR), conteniendo 1,5 µg/mL de cada toxina, y sometidas posteriormente a dos técnicas de cocinado habituales, como son el horno microondas y el hervido en dos modalidades. Se ha comprobado que ambas técnicas de cocinado son capaces de reducir los niveles de MCs libres en el pescado (Oreochromis niloticus) en un rango entre 25-50%, siendo mayor con el hervido continuo en el caso de la MC-RR. Concretamente, el hervido continuo ha demostrado ser el más eficaz, debido tal vez al mayor tiempo de permanencia de la muestra en el agua. Asimismo, tras detectar MCs en el agua de hervido, mostramos que existe un riesgo adicional inherente a la utilización de esta agua para hacer sopas de pescado. En general, estas técnicas podrían ser consideradas como medidas de control de estas toxinas en la dieta tras el consumo humano de los alimentos cocinados. Los resultados de este experimento han dado lugar a la siguiente publicación: EFFECTS OF THERMAL TREATMENTS DURING COOKING, MICROWAVE OVEN AND BOILING, ON THE UNCONJUGATED MICROCYSTIN CONCENTRATION IN MUSCLE OF FISH (OREOCHROMIS NILOTICUS). (Guzmán-Guillén y col., 2011. Food and Chemical Toxicology 49, 2060-2067). La monitorización de CYN en medios contaminados por cianobacterias es de gran importancia para evaluar los riesgos que supone su exposición para la salud y el medioambiente. Las técnicas analíticas empleadas para detectar y cuantificar esta toxina, tanto en aguas como en otras matrices, son de diverso fundamento y complejidad (ELISA, LC-DAD, LC-MS y LC-MS/MS). Sin embargo, no todos estos métodos ofrecen la misma sensibilidad. La LC-MS/MS ha sido elegida como el método ideal y de referencia para detectar y cuantificar pequeñas cantidades de toxina en muestras de agua (Eaglesham y col., 1999; Bogialli y col., 2006; Oehrle y col., 2010) y en muestras más complejas, como tejidos de peces (Gallo y col., 2009) o muestras de suero y orina humanas (Foss y Aubel, 2013). Por ello nos propusimos poner a punto y validar diferentes métodos cuantitativos, incluyendo ensayos de robustez, para la determinación de CYN en distintas matrices (aguas, cultivos de cianobacterias y tejidos de peces contaminados con CYN) por LC-MS/MS. Con el empleo de cartuchos de carbón grafitizado se obtuvieron resultados fiables en la extracción de CYN a partir de aguas y de cultivos de cianobacterias, usando una mezcla acidificada de diclorometano:metanol como disolvente. En el caso de los tejidos de peces (hígado y músculo), mediante un sistema SPE de doble cartucho (uno de C18 y uno de carbón grafitizado) conseguimos extractos limpios que permitieron la recuperación de la toxina en un alto porcentaje (80-110%). Por tanto, los métodos que proponemos han sido adecuadamente validados: con amplios rangos de concentraciones de CYN, límites de detección y cuantificación aceptables (que en el caso del agua, permiten la determinación de la toxina por debajo del valor guía propuesto por la OMS de 1 µg/L), recuperaciones en el intervalo 80-110%, y valores adecuados de precisión según la guía AOAC (Association of Official Analytical Chemists). Asimismo, la combinación de factores variables en la metodología demostró la robustez de los métodos propuestos para poder ser reproducidos bajo diferentes condiciones sin sufrir variaciones significativas en los resultados. Los métodos desarrollados en esta Tesis Doctoral pudieron ser aplicados con éxito y rapidez posteriormente para el análisis de CYN en las diferentes matrices estudiadas (aguas y matrices biológicas), permitiendo un control de la exposición, degradación, transferencia y bioacumulación de la CYN.Premio Extraordinario de Doctorado U